生物成像技术在早期疾病诊断与手术导航中的作用日益凸显，正推动临床实践由经验驱动逐步迈向精准化与个体化治疗。在影响成像性能的众多关键因素中，空间特异性与信噪比尤为重要。为实现高效生物成像，成像探针需要同时具备优异的生物相容性、良好的光学性能以及高度的靶向选择性，研究人员致力于开发长波长发射生物探针、上转换纳米材料以及双光子荧光探针，以增强组织穿透能力并降低光损伤风险。尽管上述策略已取得显著进展，但部分生物探针仍依赖外源性靶向分子实现选择性成像，这不仅增加了合成步骤与制备成本，也可能带来生物相容性方面的隐患，从而限制其实际应用。因此，找到一种构筑高效自适应、具有选择性且综合性能优异的生物成像探针的方法，仍是该领域长期以来亟待解决的核心挑战。

近期，天津大学胡文平团队吴煌课题组等通过超分子组装策略构筑了一种独特的环套笼复合物TPBCage⁶⁺⊂3CB[8]（图1），该复合物通过供体-受体型六阳离子TPBCage⁶⁺与三个CB[8]的逐步组装形成。核磁共振氢谱和密度泛函理论计算证实，所得配合物呈现出热力学稳定的C₂对称几何构像，而非预期的C₃对称构象。CB[8]的包结有效抑制了TPBCage⁶⁺的自聚集，并缩小了其能隙，导致发射峰从552 nm红移至652 nm，同时量子产率显著提高。得益于其优异的光物理性能和良好的生物相容性，TPBCage⁶⁺⊂3CB[8]实现了在深红色区域高信噪比的溶酶体选择性细胞成像，展示了环套笼组装体作为高性能生物成像稳健平台的巨大潜力。论文第一作者是王慧娟，通讯作者是吴煌教授。

图1. 环套笼复合物TPBCage⁶⁺⊂3CB[8]的分子结构式、组装示意图及其细胞成像

富电子的CB[n]通过离子-偶极相互作用以及水溶液中的疏水效应，对阳离子芳香性客体表现出高亲和力。CB[8]是CB[n]家族中尺寸相对较大的同系物，可同时包结两个相同的芳香性客体，或一个供体-受体配对的芳香性客体，进而在CB[8]的空腔内形成紧密的[π···π]堆积结构。因此，CB[8]被选作主体，用于包结TPBCage•6CF₃COO，以构筑环套笼超结构（图2a）。当向TPBCage•6CF₃COO的水溶液中逐渐加入等量的CB[8]时，在核磁氢谱中观察到一些新的共振峰，表明CB[8]能够与笼结构键合。CB[8]的包结抑制了TPBCage•6CF₃COO之间强烈的分子间[π···π]堆积，从而提高了该主客体复合物在D₂O中的溶解度。当添加一当量的CB[8]后，CB[8]中的Hb质子分裂为两个双峰，而核磁氢谱中其余的共振峰过于复杂，无法明确归属。当TPBCage•6CF₃COO与CB[8]的摩尔比达到1:2时，Hb质子的新双峰对开始出现。继续添加第三等量的CB[8]，这些新信号的强度持续增强，同时伴随着TPBCage⁶⁺⊂3CB[8]的形成。上述现象表明，三个CB[8]分子分别结合到笼结构上两个不同的位置，整体化学计量比为1:2。在向笼的水溶液中加入三等量或更多CB[8]后，¹H NMR谱图变得清晰可辨（图2b）。通过深入分析该复合物的二维¹H-¹H COSY和NOESY谱图，可以确定TPBCage•6CF₃COO中的质子归属。笼上的所有质子均明显分裂为两个峰。连接至乙烯基吡啶单元的H4/H4’和H5/H5’（δ分别为6.80/8.03和7.32/6.93），以及位于1,3,5-三苯基苯基上的H8/H8’和H9/H9’（δ分别为7.89/7.10和8.10/7.80）。这进一步表明，两个CB[8]分子结合到TPBCage•6CF₃COO的乙烯基吡啶单元上，而一个CB[8]分子则结合到靠近核心的苯乙烯单元上，形成一种环内笼结构复合物TPBCage⁶⁺⊂3CB[8]，其对称性为C₂而非C₃（图2a）。值得注意的是，在将混合时间设定为250 ms的情况下，TPBCage⁶⁺⊂3CB[8]的二维¹H-¹H EXSY光谱中观察到了交换峰，其交换速率（κ_ex）为9.7 s⁻¹。表明，CB[8]可在TPBCage⁶⁺的苯基吡啶单元上滑动，并在溶液中保持C₂对称结构。

为了深入理解环套笼结构TPBCage⁶⁺⊂3CB[8]的形成机制，我们进行了高分辨率质谱分析。可设想两种可能的键合路径：（i）协同组装，即无论TPBCage⁶⁺与CB[8]的摩尔比如何，直接形成四元TPBCage⁶⁺⊂3CB[8]复合物；（ii）分步组装，其中TPBCage⁶⁺依次逐个引入一个等量的CB[8]，先生成中间体TPBCage⁶⁺⊂CB[8]和TPBCage⁶⁺⊂2CB[8]，最终形成TPBCage⁶⁺⊂3CB[8]复合物。实验结果表明，在将等摩尔的CB[8]加入TPBCage•6CF₃COO水溶液时，观察到三个峰，其m/z分别为478.5195、596.8201和774.2739（图2c、2e），分别对应1:1配合物TPBCage⁶⁺⊂CB[8]的正六、五和四电荷态。这些发现表明CB[8]对阳离子笼具有较高的键合力。此外，还观察到了一个归属于1:2配合物TPBCage⁶⁺⊂2CB[8]的峰（图2c）。在将另一摩尔当量的CB[8]加入所得溶液后，出现了一系列新的峰（图2c、2f），其中包括m/z = 699.9153处的[TPBCage⁶⁺⊂2CB[8]]⁶⁺同位素峰以及m/z = 862.4985处的[TPBCage⁵⁺•CF₃COO⊂2CB[8]]⁵⁺同位素峰。质谱中还检测到强度相对较低的信号，来自TPBCage⁶⁺⊂CB[8]和TPBCage⁶⁺⊂3CB[8]复合物（图2c）。最后，在向TPBCage⁶⁺溶液中添加三摩尔当量的CB[8]后，分别在m/z = 921.3141和1128.3730处检测到TPBCage⁶⁺⊂3CB[8]正六电荷态和正五电荷态的同位素模式（图2c、2g），表明环套笼结构的TPBCage⁶⁺⊂3CB[8]复合物已形成。这些观察结果表明，TPBCage⁶⁺与CB[8]的包封主要遵循逐步组装路径，协同途径的贡献较小。

图2. TPBCage⁶⁺与CB[8]组装的一维核磁氢谱图和高分辨质谱图

为了进一步了解TPBCage⁶⁺及其与CB[8]复合物的超结构，进行了量子力学计算。自由状态下的TPBCage⁶⁺呈三角棱柱几何构型（图3a），具有三个较大的矩形窗口，平均尺寸为7.0×23.0 Å（图3b）。笼中两个TPBP螺旋桨之间的重心到重心距离为10.1 Å（图3b），比两个氮原子间的距离（7.0 Å）更长，表明该笼结构具有较高的柔韧性。在对TPBCage⁶⁺⊂3CB[8]的超结构进行理论计算时，观察到两种能量相对较低的键合模式（分别称为键合模式A和B）。在键合模式A下，三个CB[8]分子均键合到乙烯吡啶基单元上（图3c），形成C₃对称的超结构。此时，两个TPBP中心到中心之间的距离从10.1 Å减小至4.2 Å（图3d）。由p-甲苯二烯连接体桥接的两个氮原子之间的平均距离为5.5 Å，较自由状态下笼的7.0 Å更短。键合模式B表现出C₂对称性（图3e），其中两个CB[8]分子与乙烯基吡啶单元结合，而一个分子则与靠近核心的苯乙烯单元结合。两个末端氮原子之间的平均距离为5.8 Å（图3f），比键合模式A中的距离（5.5 Å）更长，表明具有C₂对称性的复合物所受的应力小于具有C₃对称性的复合物。两个TPBP螺旋桨之间的距离为4.2 Å，比两个末端氮原子之间约5.8 Å的距离更短。这种独特的构象使形成的环套笼结构复合物在水溶液中稳定性更高，因为CB[8]的解组装需要其穿过相对较高的p-甲基苯单元。C₂对称的TPBCage⁶⁺⊂3CB[8]复合物的键合能比C₃对称的低8.3 kcal·mol⁻¹，表明键合模式B在热力学上更为有利，这与氢谱观测结果一致。此外，还计算了这两种键合模式的环套笼复合物中中心TPBCage⁶⁺的应变能。根据DFT计算，在键合模式A下，由CB[8]包裹的中心TPBCage⁶⁺的应变能比键合模式B高出8.9 kcal mol⁻¹，进一步表明C₂对称结构在热力学上更有利。

图3.TPBCage⁶⁺和TPBCage⁶⁺⊂3CB[8]的结构优化图

为了研究CB[8]包结对TPBCage⁶⁺光物理性质的影响，进行了紫外-可见分光光度法滴定实验。在逐渐向TPBCage⁶⁺水溶液中加入等摩尔的CB[8]时，TPBCage⁶⁺在380 nm处的吸光度逐渐下降，并向长波方向移至401 nm（图4a和4c）。这些观察结果表明，笼状结构中的TPBCage•6CF₃COO已从水相迁移至CB[8]的空腔内，且两个TPBP单元被CB[8]压缩。当再加入一个等量的CB[8]时，吸收峰的下降程度和红移幅度明显小于首次添加时的情况（图4a和4c），因为第二个CB[8]的包结对笼结构的构象和电子性质影响较小。当与第三个CB[8]键合时，主吸收峰向长波方向移动至411 nm。当使用更多当量的CB[8]进行滴定时，450 nm处的吸光度未出现显著变化，而是趋于平台（图4b），这证实了TPBCage⁶⁺与CB[8]在环套笼复合物中具有1:3的化学计量比，结果与¹H NMR和HRMS分析一致。通过紫外-可见光滴定实验对440 nm处吸光度变化进行非线性最小二乘法分析，得出了表观键合常数（K_a）为1.25 × 10⁷ M⁻¹。

在逐步向TPBCage⁶⁺水溶液中添加CB[8]后，荧光最初被淬灭，随后强度增加，并伴随明显的蓝移（图4d）。当等摩尔地向TPBCage⁶⁺溶液中加入CB[8]时，552 nm处的荧光强度急剧下降（图4d），同时发射峰发生79 nm的红移（图4f），这归因于二元复合物TPBCage⁶⁺⊂CB[8]的形成。随着再加入两个等量的CB[8]，荧光强度明显增强，量子产率提高至15.24%（图4d）。这种量子产率的提升源于CB[8]的包结作用，它降低了笼结构的灵活性，从而抑制了不利的非辐射衰减。值得注意的是，形成的TPBCage⁶⁺⊂3CB[8]复合物表现出以652 nm为中心的深红色发射，相较于TPBCage⁶⁺红移了100 nm（图4f），因为CB[8]的包结显著缩小了笼体的能量间隙。随着CB[8]的添加，溶液的发光颜色逐渐从黄色转变为红色。

图4. TPBCage⁶⁺和CB[8]组装的紫外-可见光吸收滴定和荧光滴定光谱图

在成功实现TPBCage⁶⁺⊂3CB[8]的深红色发射后，我们探讨了其在生物成像中的应用可行性。首先，通过将正常NIH3T3细胞置于不同浓度TPBCage⁶⁺的培养基中，在37°C条件下孵育，孵育后的细胞经Hoechst 33342 和碘化丙啶染色后，用荧光显微镜成像，并通过细胞存活率计算评估TPBCage⁶⁺的毒性。比较不同浓度TPBCage⁶⁺对细胞存活率的影响结果发现，当TPBCage⁶⁺浓度为5 μM时，细胞存活率仍高于95%；在24小时后，浓度为25 μM时细胞存活率仍保持在85%以上，表明TPBCage⁶⁺具有相对较低的细胞毒性，具备潜在的生物成像应用价值。随后，采用共聚焦激光扫描显微镜技术，进一步考察TPBCage⁶⁺和TPBCage⁶⁺⊂3CB[8]在细胞及亚细胞结构中的成像能力。首先，将NIH3T3细胞分别在PBS溶液中与5 μM的TPBCage⁶⁺和TPBCage⁶⁺⊂3CB[8]孵育，然后使用LysoTracker Red DND-99和SYTO 9进行共染色，分别用于标记溶酶体和细胞核。随后，通过倒置显微镜对培养细胞进行成像。在激发波长为405 nm时，发现TPBCage⁶⁺（图5a）会自发聚集在靠近细胞膜附近形成微棒状结构。这归因于TPBCage⁶⁺的溶解度较低以及分子间强烈的[π···π]堆积作用，从而阻碍了其在细胞内的有效摄取，限制了其作为细胞染色剂的效果。相比之下，TPBCage⁶⁺⊂3CB[8]能够顺利穿过细胞膜，并在细胞内均匀分布（图5d）。两组样品还分别在573 nm和488 nm激发波长下进行了成像，以与LysoTracker Red DND-99（图5b和5e）和SYTO 9的染色结果进行比较。将405 nm和573 nm激发的荧光图像合并后，TPBCage⁶⁺⊂3CB[8]的蓝光发射峰与LysoTracker Red DND-99的红光发射峰表现出高度一致的共定位（图5f），整体皮尔逊相关系数达0.78；而TPBCage⁶⁺的发射峰则与LysoTracker几乎无重叠（图5c）。突显了“环套笼”结构在实现溶酶体选择性成像中的重要作用。环套笼复合物中两个暴露的吡啶单元可能与溶酶体内高效的细胞摄取和滞留相关，而其余的吡啶单元则部分被CB[8]屏蔽，这可能在一定程度上导致非特异性细胞染色减少。因此，这些特性赋予TPBCage⁶⁺⊂3CB[8]复合物更强的溶酶体聚集能力和更优的成像选择性。TPBCage⁶⁺和TPBCage⁶⁺⊂3CB[8]的蓝色发射均未与SYTO 9的绿色发射重叠，表明它们均未进入细胞核。

图5. NIH3T3细胞与TPBCage⁶⁺和TPBCage⁶⁺⊂3CB[8]以及LysoTracker染色后的激光共聚焦成像图。

通过CB[8]包结TPBCage⁶⁺实现选择性溶酶体标记后，对TPBCage⁶⁺⊂3CB[8]复合物的长波长成像能力进行了检测。使用共聚焦显微镜对经TPBCage⁶⁺和TPBCage⁶⁺⊂3CB[8]染色的NIH3T3细胞进行成像，以评估其在不同通道下的成像性能。如明场图像所示，TPBCage⁶⁺自发聚集为长度可达20 μm的细长微棒状结构，并保持在细胞外区域（图6a）。然而，在经TPBCage⁶⁺⊂3CB[8]染色的细胞明场图像中未观察到大尺寸聚集体（图6d），表明在相同条件下，该复合物在细胞内分布良好。在激发波长为458 nm时，通过改变PMT探测器的采集范围，分别在绿色（470–550 nm）、黄色（550–650 nm）和红色（650–785 nm）通道下对TPBCage⁶⁺和TPBCage⁶⁺⊂3CB[8]染色的细胞进行成像。结果显示，TPBCage⁶⁺染色的细胞在黄色通道中清晰可见，但在绿色和红色通道中几乎无法检测到（图6b、6c）。相比之下，标记有TPBCage⁶⁺⊂3CB[8]复合物的细胞在红色通道中表现出强烈的红色发射光，具有较高的信噪比，这表明形成“环套笼”复合物后，其深红色生物成像性能显著提升（图6f）。所有这些观察结果表明，用CB[8]包结阳离子笼提供了一种有效的策略来显著改善其细胞成像性能，增强空间特异性并实现更优异的深红色生物成像能力。

图6. NIH3T3细胞与TPBCage⁶⁺和TPBCage⁶⁺⊂3CB[8]染色后在不同通道的激光共聚焦成像图

综上所述，通过供体-受体型六价阳离子笼与葫芦[8]脲之间的逐步超分子组装，构建出一种环套笼复合物TPBCage⁶⁺⊂3CB[8]。三个CB[8]大环结构紧密包裹六价阳离子笼，形成热力学稳定的C₂对称超结构。CB[8]的包结有效抑制了分子间的π–π堆积作用，从而提高了该复合物在水中的溶解性。此外，CB[8]的包结还缩小了笼的能隙，使发射光谱从552 nm明显红移至652 nm，同时荧光量子产率显著提高。与传统的主客体复合物相比，环套笼结构具有多位点结合基序，形成了一种在复杂生理环境中仍能保持完整性的稳定复合物。其C₂对称构象保留了两个暴露的吡啶基单元，在一定程度上相较于游离笼可减少生物成像中的非特异性相互作用，有助于在活细胞中实现溶酶体选择性成像。得益于其明亮的深红色发射、优异的生物相容性和固有选择性，TPBCage⁶⁺⊂3CB[8]复合物能够在深红色区域实现高信噪比的高特异性溶酶体成像。本研究验证了可设计的分步超分子组装在水相环境中实现精确结构与光物理调控的潜力，并揭示了一种独特的“环套笼”识别基序，为构建高性能、高选择性的生物成像探针提供了理论设计依据。

Angew. Chem. Int. Ed., 2026, DOI: 10.1002/anie.7910152